全自动多维制备液相色谱系统

1. 引言

在中药、制药、化妆品和保健品等领域，高纯的原料是必不可少的。高纯化学品的获得，依赖于制备液相色谱（也叫层析）。中药、食品、海洋生物等来源的活性物质，样品基质复杂，往往需要多步色谱纯化（层析）才能得到一定量的纯品。在多步骤的纯化过程中，每一个步骤都需要进行上样、洗脱、收集馏分、旋蒸、冻干等步骤，样品容易污染，也会因为温度、光照、氧化等因素导致样品变质，此外，这些步骤所需要的人工、试剂、时间、设备等条件，导致了最终产品的价格居高不下。

二维液相色谱（2D-LC）是将两种不同分离机理的色谱模式联用，在线进行两步纯化，具有速度快、无样品污染和变质等优点。特别是二维液相色谱具有非常高的峰容量（其峰容量是单独两维色谱峰容量的乘积），适合复杂天然产物的分离纯化。二维液相色谱可以高通量的获得大量化合物单体，这在活性物质筛选（药物筛选、食品营养因子、化妆品功效成份和天然药物化学等）中具有巨大的优势。我们开发了一机多用的二维液相色谱系统，包括控制软件和自动化馏分收集器，完成了技术的商业化，形成了“全自动多维液相色谱系统”产品（图1），可供各科研机构使用。

1 全自动多维制备色谱系统实物图

2. 全自动多维制备色谱系统介绍

分析型二维液相色谱已经比较成熟，有多个商业化的产品。分析和纯化有着非常大的差别，分析型二维液相色谱目的在于获取信息，只要能看到峰就可以了；而制备型二维液相色谱的目的在于获得足够量的化合物纯品。因此，从分析到制备，可能遇到多个难题：

1）纯化过程通常更昂贵，设备体积大，方法开发困难；

2）样品的溶解度、上样量的优化、馏分收集后的组分稳定性，以及两维流动相溶剂不相容性；

3）最重要的问题是，以切换阀和定量环为接口的二维液相色谱系统实际分离效果是大打折扣的。由于定量环体积的限制，第一维的流速非常低，远低于van Deemter方程的最佳流速，因此，第一维的柱效是打了折扣的；由于定量环体积的限制，第二维必须在极短时间内完成，所以，短柱子、高流速是第二维的特点。这导致第二维的柱效也是打了折扣的。

制备型 LC 需要相对较长的分离时间来确保峰的纯度和馏分的收集。因此，我们开发了基于捕集柱阵列的二维液相色谱系统和控制软件（图2），第一维可以以正常流速运行，洗脱下来的馏分，被十八支捕集柱捕获，实现了在线脱除溶剂和浓缩馏分；第二维也是以最佳流速运行，十八支捕集柱上的样品，依次进行第二维纯化-收集纯品。这样，系统获得了最大的分离效率，才是制备型二维液相色谱最主要的功能。

图2 全自动多维制备色谱的软件控制界面

3. 二维和三维纯化的实例

在样品纯化方面，我们以秦皮的化学成份发现为例，进行系统性能的展示。第一维采用萘柱 (NAP)，第二维采用RP-C18，从而使系统具有更好的正交性。为了进一步增加正交分离，两维分别使用甲醇和乙腈作为流动相。

秦皮乙醇提取物上样后，进行二维制备。第一维的色谱峰在整个时间段内均匀分布（图3A），第一维洗脱液被分成 18 个部分（每个 4 分钟），并被 18 个捕集柱捕获；第一维分离完成后，依次将18个捕集柱上捕获的样品冲洗到第二维进行分离（图3B，仅展示5-14馏分），并通过馏分收集器自动收集馏分。从馏分10 (F10) 中分离出 11 种化合物，纯度> 90%，从馏分 11 (F11) 中分离出 9 种化合物，纯度>90%（图3C）。通过制备型二维液相色谱运行（耗时 22 小时），总共从秦皮中分离出36种化合物，纯度>90%。请注意，这是获得了纯品化合物，而不是分析二维中仅仅看到色谱峰而已！

我们用更复杂的样品，白头翁汤作为实例进行系统验证。通过上样 500 mg 白头翁汤浸膏，并通过一维分离，15个馏分被捕获并转移到二维。通过制备型二维液相色谱分离得到40个化合物，纯度> 90%；其中 11 种化合物的含量 > 1 mg，最多的化合物达 21.18 毫克！作为药物筛选、活性评价，足够了！

图3 制备型二维液相色谱纯化秦皮中的化学成份。

这套设备还可以做三维分离，此时，十八个捕集柱分成两组，第一组九支捕获第一维的馏分，并作为上样柱进样到第二维纯化；第二组九支捕获第二维的馏分，并作为第二维上样柱进样到第三维进行纯化；三维纯化的化合物，由馏分收集器自动化收集，如图4所示。

图4 制备型三维液相色谱纯化白头翁汤中的化学成份

4. 四维乃至五维色谱纯化？？

我们提出的基于捕集柱阵列的二维液相色谱系统，是具备四维和五维色谱纯化能力的。对五维的纯化过程，如图5所示。我们没有进行验证，有兴趣的科研院所，可以自己探索；也可以根据这一原理，申报基金/项目等，来进一步开发设备。

图5 五维色谱纯化原理

5. 中试级二维液相色谱-烟草中化学成份纯化实例

烟草是中国重要的经济作物之一，在烟草的种植和生产加工过程中，产生了大批烟叶废弃物。一方面，烟叶废弃物的传统处理方式对环境造成了一定的压力和污染；另一方面，烟叶中已知含有300多种化合物，其中的生物碱、糖类、氨基酸、有机酸等是重要的医药、食品原料。以烟叶为样品，对其中可以作为医药原料中间体的四个组份进行中试级纯化。

常规制备型2D-LC系由于切换阀和系统设计，多以实验室规模纯化少量物质以进行结构鉴定和药效活性评价为目标，较难以同样的系统设计放大到工业化规模。为了实现规模化生产，系统可靠性至关重要。因此，构建了以四位切换阀和捕集柱阵列为接口中试级二维液相色谱系统，通过创新设计的系统切换流路，实现多组分的在线二维制备，并具有易于放大到生产规模的优点。研制过程中使用了结构相对简单可靠的两位四通阀替代多位阀，各管路连接简单，维护方便，原型机实物图如图6所示。同时，切换系统的布局使所有液路都有出口，即使出现切换错误也不会导致液路封闭引起局部的超高压，泄露等安全生产危险。

图6 中试级二维液相色谱实物图

纯化烟叶中的四种活性化合物的色谱图如图7所示。经过分离烟叶中的四个主要活性成分，验证了系统简单可靠，且各模块控制及在线监测系统运行正常。经过第二维分离后，获得的烟碱、绿原酸、芸香苷的纯度均大于95%，而茄尼醇的纯度大于80%（与市售对照品纯度相当）。该在线二维液相色谱系统有效地实现了目标组分的纯化。

该系统采用四通阀代替了常规制备二维液相色谱中的多位选择阀，并进行了创新的接口设计，结合捕集柱阵列模式，能灵活地选择性分离烟草中的目标化合物，实现四个组分的高纯化合物的规模化生产。同时，采用了中压色谱系统，以50 μm粒径填料为分离介质，系统压力低，对设备的要求大大降低，更易实现自动化操作和放大到制备规模，在烟草的快速分离制备和工业化生产方面具有广阔的应用前景。该设计不仅可以把一维的馏分切割成多组，实现全二维和中心切割两种模式的任意切换；还能多次上样，富集大量目标组分，再切换系统运行二维模式，提高单次制备量。

图7 在线二维液相色谱分离烟草提取物

6. 结语

我们提出了捕集柱阵列模式的制备型二维液相色谱，并进行了产品开发，形成了全自动多维色谱系统。该系统的概念设计和运行模式，可以一机多用，实现二维、三维，乃至五维的分离纯化。本文中以秦皮、白头翁汤和烟叶的纯化为例进行了展示，也可以应用到其他天然产物的分离纯化中，实现复杂成分的高效纯化。此外，本系统经过了中试级规模验证，为规模化大生产奠定了基础。

相关文献：

1. 基于捕集柱阵列的制备型二维液相色谱纯化烟草中的４个组分. 色谱 2023, 41 (3), 281-286.

2. Less Configuration and More Dimensionality: Preparative Heart-Cut Multidimensional Liquid Chromatography Based on Trapping Arrays. Anal Chem 2022, 94 (49), 16997-17002.