氢气的摄入可防止慢性身体拘束应激在小鼠中引起的海马依赖性学习任务的损害。

拘束应激或束缚应激，是一种经典的躯体应激动物模型，能对动物产生严重的应激损伤，主要是大脑学习记忆能力和情绪方面。这种模型相对比较容易做，就是比较麻烦，每天要把动物绑起来，在没有视频条件的时期，需要实验人员一直在场观察。但这种模型的稳定性比较好，这在心理学方面是难得可贵的。本研究发现氢水饮用后能改善这种经典动物模型的多种表现，强烈提示氢气在心理学尤其是抑郁和焦虑等这类常发精神类疾病中的潜在价值。后来氢气和氢水对人类的抑郁焦虑和疲劳综合征等方面的研究，也说明这种效应可能真实存在。可惜目前缺乏这方面系统全面的强证据临床试验结果。但我个人比较相信，氢气能增强人的幸福感，使用氢气，幸福满满。也有人说可能存在安慰剂效应，当然会存在，即使药物和医疗手段，安慰剂效应都广泛普遍存在，但是安慰的效果并不一样，安慰的条件也不一样，如果喝水这种简单的安慰能让人幸福，安慰有错吗？

我们已经报道了氢气通过气体快速扩散作为一种有效的抗氧化剂的作用。当将饱和氢的水（氢水）放入大鼠的胃中时，血液中检测到几个μM水平的氢气。由于不适合连续消耗氢气，我们用小鼠研究了自由饮用氢水而不是吸入氢气是否可以通过减少氧化应激来预防认知障碍。对小鼠进行慢性身体拘束应激增强了大脑中氧化应激标志物丙二醛和4-羟基-2-壬烯醛的水平，并损害了学习和记忆能力，这是通过三种不同的方法来判断的：被动回避学习、物体识别任务和莫里斯水迷宫。在整个期间自由饮用氢水抑制了氧化应激标志物的增加，并通过所有三种方法预防了认知障碍，而没有提供应激时，氢水并未改善认知能力。通过5-溴脱氧尿苷掺入和Ki-67免疫染色观察，海马齿状回中的神经增殖被拘束应激所抑制，这些是增殖标志物。氢水的消耗改善了减少的增殖，尽管氢依赖性的神经发生和认知障碍之间的机制联系尚不清楚。因此，连续消耗氢水可以减少大脑中的氧化应激，并防止由慢性身体束缚引起的学习和记忆下降。氢水可能适用于预防性使用于认知或其他神经障碍。

引言

氧化应激被广泛认为是导致神经元脆弱性的一个因素。因此，适当的抗氧化剂被期望保护大脑中的神经前体和神经元免受氧化损伤；然而，大多数抗氧化剂由于血脑屏障的原因无法到达神经元。我们最近报道了氢气(H2)可以减少氧化应激，并且可以通过气体扩散穿透血脑屏障以保护神经元；然而，吸入氢气可能不适合作为连续氢消耗用于预防性使用。一份简要报告表明，摄入含有饱和水平氢的水（氢水）可以减少大鼠体内的氧化应激，如尿中氧化鸟嘌呤和肝脂质过氧化物水平降低所示。因此，我们检查了氢水对由氧化应激引起认知下降的影响。

成年海马神经发生可能涉及认知功能，包括学习和记忆以及空间识别。抗抑郁药增加了成年神经发生，这表明抑制成年神经发生可能对某些精神障碍负责。在这里，我们展示了当慢性身体应激应用于小鼠时，连续消耗氢水减少了大脑中的氧化应激，并防止了祖传神经细胞增殖的下降和认知功能的损害。

材料与方法

氢水

氢气在高压（0.4 MPa）下溶解于水中至过饱和水平，使用由Blue Mercury Inc.（日本东京）生产的氢水生产设备（第2版）。饱和氢水（500 ml）在常压下储存于一个无死角的铝袋中。每周新鲜准备氢水，确保浓度保持在0.6 mM以上。我们用氢电极（ABLE）确认了氢含量。每天，从铝袋中取出氢水放入一个带有出口管线的封闭玻璃容器（70 ml）中，出口管线上有两个滚珠轴承，防止水分脱气。这个容器确保1天后氢浓度仍超过0.4 mM。通过轻轻搅拌使氢水脱气后用于对照动物；用氢电极确认氢气完全移除。

血液中氢气的测量

将氢水（3.5 ml，0.8 mM）通过导管放入大鼠（约230 g）胃中。3分钟后，从心脏收集5 ml静脉血，并放入装有25 ml空气的小铝袋中。血液中的氢气转移到空气中后，从铝袋中取出20 ml空气进行气相色谱分析，以检测氢含量（参见Ohsawa等人，2007）。

丙二醛的测定

使用Bioxytech MDA-586测定试剂盒（OxisResearch，俄勒冈州）确定大脑丙二醛（MDA）水平。简要地说，冷冻的左半脑在丁基化羟甲苯的存在下均质化。离心后，上清液中的游离MDA通过与N-甲基-2-苯基吲哚的化学反应转化为稳定的碳菁染料（最大吸收波长为586 nm）。MDA水平根据蛋白质浓度进行标准化。

身体拘束应激

本研究经日本医科大学动物护理和使用委员会批准。我们从CLEA Japan Inc.（日本东京）获得7周龄（体重33-34 g）的ICR小鼠，并将40只小鼠分为四组（每组10只），通过以下组合：应激和CTL：分别有无拘束应激的组。HW(+)和HW(−)：分别给予含氢水和不含氢气的水。每只小鼠被放置在一个3×3×7.5 cm的不锈钢笼中，这限制了它们的运动，但允许它们随意饮水。每天给予10小时（0900-1900小时）的固定应激，每周6天。每只被固定的小鼠在剩余时间单独饲养在一个多隔间笼的10×10×10 cm的小隔间中，以避免攻击性行为并防止社会孤立。在整个期间内，氢水或脱气水随时可用。未受应激的小鼠被安置在标准大小的笼子里，每笼五只，并且每天无应激地处理。提供拘束应激和进行实验的时间表如图1所示。

图1拘束应激实验和进行实验的时间表如图所示。单条杠表示使用同一批小鼠的一系列实验。PA、ORT、WM、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、Ki-67和OS分别表示进行被动回避、物体识别测试、莫里斯水迷宫、BrdU注射以及Ki-67和氧化应激（4-羟基-2-壬烯醛（HNE）染色和丙二醛（MDA）测量）的时间点。在进行莫里斯水迷宫实验期间，小鼠继续每天被固定8小时。

被动回避学习

该装置由两个隔间组成，一个亮的一个暗的，中间用一个垂直滑动门隔开（参见O’Riordan等人，2006）。我们最初将一只小鼠放在亮隔间中20秒。门打开后，小鼠可以进入暗隔间（小鼠本能地更喜欢待在暗处）。小鼠进入暗隔间后，门关闭。20秒后，给小鼠一个0.3 mA的电击持续2秒。允许小鼠恢复10秒，然后返回到饲养笼中。24小时后，再次将小鼠放在有灯光的部分，并打开门让小鼠移动到暗区。我们记录了小鼠穿过门的潜伏时间。此外，还记录了在亮区停留超过300秒的小鼠数量。

物体识别任务

使用新颖物体识别和记忆保持测试来检查识别记忆。将一只小鼠在笼子中习惯4小时，然后向小鼠展示两个不同形状的物体作为训练，持续10分钟。计算在最初的5分钟时间内，对其中一个物体（将被替换为新物体）的探索和/或嗅闻的次数（训练）。为了测试1天后的记忆保持，将原始物体之一替换为形状不同的新物体，然后计算5分钟内对新物体的探索和/或嗅闻的次数（保持测试）。识别指数以探索和/或嗅闻原始物体或新物体的频率（%）获得。

空间学习

对小鼠进行了莫里斯水迷宫的训练，连续6天每天进行四次试验。水迷宫是一个充满室温水的圆形池子（直径125厘米；高度55厘米；水温24±1°C）。一个透明的平台（直径10厘米）隐藏在水面下1厘米处，水中加入了白色无毒油漆使其变浑浊。起点每天都改变。每次试验持续直到小鼠找到平台或最多60秒。考官使用秒表和视频确定小鼠到达平台的游泳时间（潜伏期）。所有小鼠在平台上休息20秒。在第6天最后一次训练后的24小时进行探试。在最后一次训练试验后1小时评估空间训练的保持情况。单次探试包括在没有平台的池中自由游泳60秒。小鼠被放置并在平台所在位置的对面释放，记录探试期间在每个象限中花费的时间。在实验期间，小鼠继续每天被固定8小时，而不是10小时。

免疫组织化学

经过8周的拘束应激后，在麻醉下通过心脏灌注法用生理盐水灌注小鼠。移除右侧大脑半球和小脑半球，并在室温下用4%的甲醛溶液固定24小时。用振动切片机（Leica, Cambridge, UK）沿冠状面切下40微米的切片，并将其浸入PBS中。

5-溴脱氧尿苷 (BrdU) 免疫组织化学

将5-溴脱氧尿苷 (BrdU, Sigma) 溶解在0.9% NaCl中，并通过过滤进行灭菌。经过6周拘束应激后，小鼠连续5天每天以每毫升10微克的浓度腹腔注射50毫克/千克体重剂量。切片在37°C下用2N HCl孵化30分钟以变性DNA，然后在甲醇中的3% H2O2中进一步孵化30分钟，并使用M.O.M.试剂盒中的小鼠Ig阻断试剂阻断1小时。所使用的一抗是小鼠单克隆抗-BrdU抗体（BD Pharmingen，稀释比例为1:100）。

Ki-67和4-羟基-2-壬烯醛 (HNE) 免疫反应

经过8周拘束应激后，将切片在90°C下的10mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）中孵化5分钟，然后在室温下冷却，再在37°C下在甲醇中的3% H2O2中进一步孵化30分钟，然后分别使用M.O.M.试剂盒和Vectastain ABC试剂盒（Vector Laboratories）中的正常山羊血清进行阻断。所使用的一抗是兔多克隆抗-Ki-67抗体（Abcam，稀释比例为1:500）和小鼠单克隆抗-HNE抗体（20μg/ml; JaICA, Fukuroi, Japan）。HNE二抗以及BrdU和Ki-67的二抗应用了2小时。然后应用avidin/biotinylated mouse peroxidase complex2小时，最后用3′3-二氨基苯甲胺（Sigma）染色1分钟。

线挂试验

经过6周拘束应激后，通过线挂试验测试神经肌肉力量。简而言之，将小鼠放在轻轻摇晃的铁丝网上，导致小鼠抓紧铁丝网。20秒截止时间过后，将铁丝网倒转180度，记录小鼠掉落的时间。

旷场试验

经过7周拘束应激后，为了旷场试验（Kim和Han，2006），在白色Plexiglas室（36×30×18厘米）的开放场中测量了运动活动。每只小鼠被单独放置在开放场的左角落，并记录指定的时间段内的活动。根据20分钟内的总站立得分评估水平运动活动。

统计分析

所有值均以均值±标准误差测量值（SEM）表示。组间差异采用一维或两维ANOVA分析。当发现统计差异时，执行Fisher’s PLSD事后检验。统计显著性接受标准为P<0.05。所有实验均采用盲法检查。

研究结果

氢水降低物理约束诱导氧化应激

首先，我们检验了通过饮用氢水是否能使氢气充分融入体内。由于从小鼠身上获取足够血量存在困难，我们使用大鼠来测量血液中的氢气浓度。我们通过导管直接向一只体重230克的大鼠胃中注入3.5毫升的饱和氢水（相当于每公斤体重15毫升）。3分钟后，在血液中检测到了5微摩尔（μM）水平的氢气（见图2a）。另一方面，一个未发表的结果表明，用针型氢电极监测时，注射氢气后，氢气在大鼠肌肉中的半衰期大约为20分钟（数据未显示）。

图2显示，饮用氢水减少了由拘束应激增强的氧化应激。(a) 通过导管直接向大鼠胃中注入3.5毫升的氢水后3分钟，测量血液中的氢气（H2）。气相色谱分析的结果如图所示。(b) 在经历8周的拘束应激后，海马区用抗-4-羟基-2-壬烯醛（HNE）结合肽抗体染色。展示了HNE染色的代表性照片。箭头指示阳性细胞。比例尺：左上角面板，100微米；放大面板，25微米。(c) 使用四个连续切片计数齿状回中的HNE阳性细胞（F(2, 27)=28.031; P<0.0001）。(d) 全脑中的丙二醛通过生化方法测定（F(2, 27)=4.177; P=0.0263）。CTL，无应激对照组；Stress，暴露于8周拘束应激的组；HW(+)，提供氢水的组；HW(−)，提供脱气水的组。数据以均值±SEM表示（每组有10只小鼠）。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001与Stress+HW(−)组相比。

我们使用小鼠进行拘束应激的实验。为了检验小鼠是否偏好饮用氢水，我们测量了小鼠自由饮水所消耗的水体积。无论是饮用氢水还是脱气水的小鼠，每只小鼠饮水量几乎相同（3.77±0.11 vs 3.75±0.08毫升，SEM）。

然后，每只小鼠每天单独被放置在一个非常小的笼子里，每天持续10小时，这个笼子完全限制了它的运动，但允许它自由饮水，然后在一个小隔间里饲养14小时，如“材料和方法”所述。这些处理每周继续6天。在整个周期内，水始终可以自由获取。

通过免疫组织化学评估HNE来检查大脑中的氧化应激水平，HNE是脂质过氧化物的最终产物（Ohsawa等人，2003年），经过8周的拘束应激后（图2b，c）。另一个氧化标记物，MDA，使用生化方法估计（图2d）。这些结果显示，慢性拘束应激增强了大脑中的氧化应激。值得注意的是，饮用氢水抑制了氧化应激标记物的积累（图2b-d）。

被动回避学习、新认知测试和莫里斯水迷宫

我们使用被动回避测试来检查学习和记忆能力。小鼠本能地偏好暗室；然而，如果在暗室中给予电击，小鼠通常会不愿意重新进入。在拘束应激后的1或2周，提供对照脱气水的小鼠倾向于失去电击的记忆（图3a，b）。另一方面，自由饮用氢水的小鼠表现出改善学习和记忆的趋势（图3a，b）。六周的拘束应激显著损害了没有饮用氢水的小鼠的学习和记忆能力，而自由饮用氢水显著改善或预防了由拘束应激引起的认知障碍（图3c，左面板）。特别是，比没有氢水的对照组更多的小鼠（四倍）在光照部分停留超过300秒（图3c，右面板）。另一方面，当没有提供应激时，饮用氢水并不会提高认知能力（图3c）。

图3显示，氢水预防了由拘束应激引起的认知能力下降。在施加拘束应激1周（a）、2周（b）和6周（c）（F(3, 36)=7.661; P<0.0005）后，通过检查条件试验第一天从明室到暗室的步进延迟时间来执行被动回避测试（条件作用）。在暗室中给予电击24小时后，测量小鼠从明室移动到暗室的延迟时间（24小时）。当小鼠在300秒内没有进入暗室时，延迟时间记为300秒。第二天在明室中停留超过300秒的小鼠数量如图所示（右面板）。Stress和CTL分别表示有无拘束应激的组；HW(+)和HW(−)分别表示给予含氢水和脱气水的组。(a)、(b)和(c)中的实验使用了不同的小鼠。*P<0.01和**P<0.001与Stress+HW(−)组相比。数据以均值±SEM表示（每组有10只小鼠）。

作为确认拘束应激后认知功能受损的另一种方法，我们应用了物体识别任务。如果小鼠记得一个物体，当原始物体被一个新物体替换时，它们更倾向于探索和/或嗅闻新物体。经过3周的拘束应激后，氢水倾向于预防或恢复对新物体识别的下降，表现为探索或嗅闻新物体的频率减少（图4a）。在6周的应激后，小鼠进行了第二次物体识别任务，因为如果第二次使用的物体与第一次检查中使用的完全不同，就可以进行第二次测试。当拘束应激应用6周时，自由饮用氢水显著预防或恢复了识别和记忆的下降（图4b）。应当注意的是，如果没有提供应激，饮用氢水并不能提高认知能力（图4b）。

图4显示，物体识别任务表明氢水预防了由拘束应激引起的认知能力下降。对于物体识别任务，在施加拘束应激3周（a）或6周（b）（F(3, 35)=7.466; P<0.0005）后，向小鼠展示两个不同的物体10分钟进行视觉训练，并在最初的5分钟时间内计算探索和/或嗅闻物体的次数（训练）。为了测试1天后的记忆保留，将原始物体中的一个替换为形状不同的新物体，然后计算5分钟内探索和/或嗅闻新物体的次数（记忆保留测试）。识别指数以探索和/或嗅闻将被替换的物体或已被替换的新物体的频率（%）表示。例如，如果一只小鼠只探索和/或嗅闻新物体，识别指数记为100%，而如果它只探索未改变的物体，则识别指数为0%。Stress和CTL分别表示有无拘束应激的组；HW(+)和HW(−)分别表示给予含氢水和脱气水的组。(a)和(b)中的实验使用了相同的小鼠。当第二次物体识别测试给予相同的小鼠时，使用了形状和颜色不同的物体。数据以均值±SEM表示（每组有10只小鼠）。*P<0.01和**P<0.001与Stress+HW(−)组相比。

为了测试空间识别和学习能力，我们让小鼠进行了莫里斯水迷宫测试。经过4周的拘束应激后，与无应激对照组相比，小鼠在训练后到达隐藏在水池中的不可见平台所需的时间更长，这表明它们失去了对平台位置的记忆。连续饮用氢水缩短了小鼠到达平台所需的时间，与受压对照组相比（图5a）。当不可见平台被移除时，如果小鼠保留了平台位置的记忆，它们应该在平台原来放置的地方（目标象限）附近游泳更长时间（图5b，区域A）。实际上，慢性拘束应激的小鼠根据它们的记忆损失在那个位置游动的时间比无应激对照组短（图5c，区域A）。相比之下，消费氢水的受压小鼠在目标象限区域（图5b，区域A）游动的时间比没有饮用氢水的受压对照组长，尽管没有一组在三个非目标象限区域（图5c，区域B–D）显示出显著差异。值得注意的是，饮用氢水显然改善了因拘束应激而下降的空间识别和学习能力。这个实验还表明，当没有施加应激时，氢水对改善空间认知能力没有潜力，这与之前的结果一致。

图5显示，莫里斯水迷宫表明氢水预防了由拘束应激引起的认知能力下降。在施加拘束应激4周后，测量了四天每日试验后到达隐藏平台的时间（a）。在实验期间，小鼠继续每天被固定8小时。(b) 单次探测试验包括在没有平台的水池中自由游泳60秒。探测试验所用的象限区域如图所示，平台曾位于A区域，小鼠从B区域放置并释放。（c）在日常训练后6天，移除平台后，每个区域（A–D）的自由游泳时间。通过双因素方差分析分析了两个参数（应激和氢气）。A区：F(1, 36)=4.455; P=0.042, B区：F(1, 36)=0.016; P=0.901, C区：F(1, 36)=0.933; P=0.341, D区：F(1, 36)=3.235; P=0.08。通过单因素方差分析比较A区的四组（F(3, 36)=5.074; P=0.0049）。Stress和CTL分别表示有无拘束应激的组；HW(+)和HW(−)分别表示给予含氢水和脱气水的组。数据以均值±SEM表示（每组有10只小鼠）。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001与Stress+HW(−)相比。#P<0.05, ##P<0.03与CTL+HW(−)相比；###P<0.01与CTL+HW(−)和CTL+HW(+)相比。

氢水不影响应激诱导的肌肉力量和运动能力下降

为了检验氢水是否影响全身，我们在拘束应激期间监测了体重。体重随着拘束而减少，氢水并没有克服这种减少（补充图S1）。使用线挂和旷场测试来排除氢水影响肌肉力量和运动的可能性。线挂时间取决于每只小鼠的体重，在肌肉力量上没有观察到显著差异（补充图S2）。尽管拘束应激倾向于影响运动，但在运动测试中没有观察到氢水消费的效果（补充图S3）。总之，通过三种方法观察到的行为不是由于运动能力的变化，而是表明学习和记忆能力的下降。因此，氢水组观察到的改善反映在更好的学习能力和记忆力上（图3，4，5）。

氢水改善了祖细胞的增殖

认知功能可能涉及海马体中的成年神经发生。最后，在8周的拘束应激后，我们通过计数海马体齿状回中的增殖祖细胞来检查成年神经发生与海马功能的相关性，使用BrdU标记。在齿状回边界区域的四个连续切片中，根据形状和大小判断阳性核并计数。拘束应激减少了增殖细胞的数量，氢水显著恢复了它们（图6a，b）。作为另一种方法，使用Ki-67作为增殖细胞的标志物。结果与通过BrdU标记法获得的相似（图6c，d）。这些发现表明，连续饮用氢水改善了受拘束应激损害的神经祖细胞的增殖或成年神经发生。

图6：氢气恢复了由拘束应激降低的前体细胞的增殖能力。（a）在6周的拘束应激后，小鼠被注射5-溴脱氧尿苷（BrdU）。海马体齿状回中BrdU阳性前体细胞的典型照片如图所示。箭头表示阳性细胞。比例尺：左上角面板，100μm；放大面板，25μm。（b）在四个连续切片中计数了海马体齿状回边界区域的BrdU阳性前体细胞核（F(2, 27)=4.289; P=0.0241）。（c）使用抗Ki-67抗体检查齿状回中的细胞增殖情况。海马体齿状回中Ki-67阳性细胞的典型照片如图所示。箭头表示阳性细胞。比例尺：左上角面板，100μm；放大面板，25μm。（d）在四个连续切片中计数了海马体齿状回边界区域的Ki-67阳性前体细胞（F(2, 27)=3.155; P=0.0587）。CTL，无应激对照组；Stress，暴露于拘束应激8周的组；HW(+)，提供氢水组；和HW(−)，提供去气水的组。数据以均值±SEM表示（每组由10只小鼠组成）。*P<0.05, **P<0.03, ***P<0.01 vs Stress+HW(−)。

讨论

总结来说，持续饮用氢水在整个物理拘束应激期间减少了氧化应激，防止了神经前体细胞增殖能力的下降，并防止了由慢性物理拘束应激引起的认知能力下降。本研究应用的拘束应激也可能引起相当的心理和生理应激。在本研究中，我们通过三种不同的方法检验了受损的学习和记忆能力：被动回避学习、物体识别任务和莫里斯水迷宫。在这些方法中，连续的物体识别任务是可行的，而莫里斯水迷宫对被动回避测试的结果没有影响。因此，尽管不能排除被动回避测试受到水迷宫训练影响的可能性，但一些实验还是使用了相同的小鼠进行，如图1所示。

我们最近报告说，氢气降低了羟基自由基——最具活性的氧自由基（ROS），并保护细胞免受氧化应激。吸入1%的氢气足以保护大脑和肝脏，因为在大气压下，血液中的氢气饱和水平应达到800μM。有可能持续摄入的氢气即使在比8μM低得多的浓度下也能防御大脑免受慢性氧化应激的影响。在本研究中，我们展示了从胃部进入血液的氢气浓度达到了5μM。持续接触氢气可能会改变血液成分向还原状态转变，并间接影响大脑中的氧化状态。尽管目前尚不清楚氢气是如何减少大脑中的氧化应激的，但本研究可能突出了氧化应激在学习与记忆缺陷中的重要作用。

氢水的摄入改善了由拘束应激降低的神经前体细胞的增殖能力，尽管在神经发生的变化与认知障碍之间的机制联系目前还只是相关性的。然而，成年神经发生可能涉及海马功能，包括学习和记忆以及空间识别过程，并受到多种内在和外在因素的影响。例如，成年神经发生在头部放疗、应激敏感的肾上腺激素如糖皮质激素以及身体或心理应激下受到抑制，并在炎症阻断下得到改善。当我们研究氧化应激时，我们发现越来越多的证据表明它参与了影响成年神经发生的下游因素：（1）放疗产生ROS的羟基自由基，（2）炎症阻断恢复了成年海马神经发生，这可以通过减少炎症性氧化应激来解释，（3）糖皮质激素增强了海马中氧化应激诱导的细胞死亡，以及（4）本研究和其他研究表明拘束应激本身增强了大脑中的氧化应激。

因此，有可能在暴露于物理拘束应激期间，持续摄入氢水减少了大脑中的氧化应激，从而导致成年神经发生的改善或神经增殖的刺激，进而预防了学习和记忆能力的下降。这是第一份显示饮用氢水益处的报告。因此，我们提出氢水可以通过减少氧化应激作为预防性治疗措施。