骨内给氢：一种从分子效应到组织再生的新技术

在过去的几十年里，氢气已被证明具有多样的生物效应。截至2022年底，氢医学领域已发表了2000多篇文章，其中许多是原创性研究。有一些初步证据显示，通过吸入或饮用富含氢的水摄入氢气可能具有再生效果。这里我们提出了一种通过骨内途径给予氢气的新方法，这可能会增强组织再生效果。本综述的目的是系统化关于氢气对包括干细胞在内的各种类型细胞影响的本性、特征和机制的观点，并介绍骨内给药途径潜在优势的假设。本文回顾了氢气的分子、细胞、组织和系统效应。现有文献表明，氢气的分子和细胞效应使其成为再生医学中的潜在有效因子。通过骨内途径给予氢气可能作为刺激骨髓干细胞池的最佳方式。

前言：骨组织代谢的特点及其在疾病发病机制中的作用

从系统发育的角度来看，骨是最年轻的组织。它仍处于适应重力、直立姿势，以及近几个世纪以来坐姿存在的时期。在形态功能方面，骨是最复杂和生物学上最活跃的组织之一[1, 2]。在很多方面，它超越了其他身体系统，成为最大且多功能的系统，具有高代谢和修复活性。骨髓基质的结构包括未分化的间充质干细胞——网状细胞、结缔组织细胞、骨内膜成纤维细胞样细胞、内皮细胞、脂肪细胞、分化的骨细胞（成骨细胞、破骨细胞、骨细胞）、细胞间质、骨内膜和骨外膜细胞、骨髓、血管、淋巴管和神经结构与周围软组织密切关联[1, 2]。

在骨组织中，不断发生两个相反的过程——骨吸收（骨骼分解）和骨沉积（新骨形成）。这些过程的比例取决于多种因素，包括骨骼上的物理压力、激素状态和年龄。骨生成被认为发生在骨内膜、骨外膜和骨髓细胞的作用下。骨生成的调节有三个层次：局部、系统和遗传。局部调节通过微环境进行，涉及多种细胞因子、许多生长因子、一些多肽、酶和细胞间接触。系统神经内分泌调节由激素和类激素物质进行[3,4,5]。

骨生成与血液循环之间的形态功能关系不仅在解剖学上紧密相连，而且在功能上也密切相关。这一点已经被众多研究证实，这些研究探讨了骨内外系统的动脉、静脉[6]、淋巴管[7]和神经调节与骨感受之间的关系[1]。红骨髓是一个血液储备库、造血器官、高度敏感的反射区，是免疫系统的中心环节[8]。红骨髓是几乎取之不尽的间充质干细胞成纤维细胞样细胞的来源——成骨细胞的前体，它们不仅能增强骨生成，还能构建造血微环境并调节造血本身[9]。

修复性再生是指组织在受损后的恢复过程。骨组织的生理性和修复性再生机制在质上是相同的，基于共同的模式进行。修复性再生在某种程度上是对生理性再生的加强和加速[10]。骨组织最自然、显著且强烈的修复性再生和代谢诱导因素之一是其创伤性损伤[11,12,13,14]。许多研究人员指出，通过在骨的必要区域进行截骨术、钻孔术、隧道成形术或穿孔术等方法，可以局部激发骨组织的修复性再生，从而改变其代谢。局部化和剂量化的骨组织改变被用作治疗手段，能够缓解退行性-营养障碍性疾病。治疗效果表现在刺激区的局部以及由于血循环增强导致的节段性区域[11,12,13,14]。

在对骨组织进行组织学检查时，结果显示在一天内通过骨内给药各种液体或血液会导致骨小梁破坏、骨髓基质和实质损害，以及给药部位血液循环受损。这些效应归因于针头插入骨内时的机械损伤。到了第60天，骨和骨髓组织完全恢复了它们的细胞结构[15]。

骨骼由附近的动脉供血，这些动脉在骨膜区域形成丛状结构和大量吻合支的网络。胸椎和腰椎的血液供应来自主动脉的分支，颈椎则由椎动脉供应。组织学上已证实有血管穿透骨骼[15]。通过小孔，小动脉进入骨骼，二分叉分支，并形成一个分支的封闭系统，即六边形窦腔，彼此吻合。髓内静脉丛的容量比动脉床大几十倍。由于其横截面积大，海绵骨中的血流速度极慢，在某些窦腔中会停止2-3分钟。小静脉在离开窦腔时形成丛状结构，并通过小孔离开骨骼。骨内给药方法是将药物有效输送到骨血管床的唯一途径[16]。

使用静脉脊椎造影的研究显示，当对比剂注入椎体的棘突时，注射点上方6-8个节段和下方3-4个节段的棘突和椎体海绵质的静脉均匀充盈，包括骨膜的静脉、内部和外部椎管丛的静脉、硬膜外腔的静脉、硬脑膜的静脉丛、脊神经节点和神经的静脉丛。染料渗透到棘突和椎体的海绵组织中，这表明椎管丛的静脉中不存在瓣膜[17]。

骨内血流的系统在功能上是平衡的，并受到神经系统的调节。在成骨细胞和破骨细胞过程的影响下，骨组织不断地进行积极的更新。骨髓腔中的血流与其他因素一起，与脊柱的物理影响有关[18]。当脊椎体上发生压缩载荷时，骨小梁会发生弹性变形，充满红骨髓的腔室中的压力会增加。考虑到核-关节轴的汇聚方向，例如行走时，脊椎的前右半部分会交替出现压力增加（前左减少），然后前部增加（前右减少）。红骨髓会从高压区交替移动到低压区。这让我们可以将脊椎体视为一种生物液压减震器。同时，脊椎体海绵质腔室中的压力波动有助于年轻血细胞穿透进入窦毛细血管，以及静脉血从海绵质流向椎内丛[18]。

骨内血流的中断导致骨内压力增加。这种压力的长期升高会导致骨骼的特定结构变化，包括骨内小梁的吸收和脊椎体终板海绵组织皮质层的硬化。这些变化最终可能导致囊肿和坏死的形成[19]。

一些研究人员已经在谈论“骨内伤害感受器”，它们在各种刺激的影响下被激活，尤其是在增加的骨内压力和骨髓水肿的影响下，后者是形成骨骼疼痛的最重要因素[3, 20,21,22]。

氢气的分子和细胞层面的生物作用特点

在过去的几十年里，医用气体理所当然地吸引了生物医学领域专家的广泛关注。同时，已经发现并观察到具有生物效应和有益效果的气体种类相当广泛，并且还在不断增加[23,24,25]。

最近，氢气由于其几种独特特性，在医用气体疗法中占据了特殊地位。这种气体没有特定的颜色或气味，由最轻的化学元素组成，无处不在，并且由于其体积小和最小的分子量，可以穿透任何生物屏障[26,27,28,29,30]。氢气的高生物利用度满足了任何药物剂产生生物效应的首要条件。

截至2022年底，氢气生物医学领域的知识体系正在积极更新，包括超过100项临床试验和2000多篇已发表的文章。虽然问题的各个方面都在详细考虑之中，但研究的焦点在很大程度上转向了氢气对心脏[29, 31]、神经[32, 33]和辐射防护效果[34, 35]的研究。另一方面，对于再生医学至关重要的细胞效应只是间接揭示。

为了实现这种气体分子的众多生物和有益效果，引入氢气进入身体的途径的组合是必要的。这些包括抗氧化、抗凋亡、抗炎活性、基因表达的调节等。然而，多样的分子机制首先参与介导氢气的独特效应（见图24.1）。

图 24.1氢气在生物体中的分子效应。图中展示了一些提出的机制，通过这些机制，氢气的主要效应在分子和细胞层面得到介导。棕色链接代表调节分子的变化，导致特定细胞效应（由绿色块表示）的发展。缩写：MAPK - 丝裂原活化蛋白激酶，HO - 血红素加氧酶，TNF - 肿瘤坏死因子，SOD - 超氧化物歧化酶，MPO - 髓过氧化物酶，NOS - 一氧化氮合酶（诱导型 - iNOS; 内皮型 - eNOS），GPx - 谷胱甘肽过氧化物酶，Cas - 半胱天冬酶，HMGB1 - 高迁移率族蛋白B1，NLRP - 核苷酸结合寡聚域，Th - T细胞毒性淋巴细胞。经允许转载自《氢气：从分子效应到干细胞管理》，作者 Mikhail Yu. Artamonov 等，《抗氧化剂》2023年，第12期，第636页。

抗氧化效应

目前，许多研究假设氢气对氧化代谢状态的影响包括直接捕获自由基和对抗氧化系统的调节作用。所讨论的气体的抗氧化效应的第一组成部分是通过氢气与有毒氧化剂直接相互作用实现的，主要是羟基（•OH）和过氧亚硝酸盐（ONOO−）[36]。这一点至关重要，因为这些氧化剂分子具有最大的氧化活性，这可以通过使用特定的荧光探针（2’，7’-二氯二氢荧光素； DCF）来显示[37]。需要强调的是，氢气是一种新型抗氧化剂，因为它选择性地清除•OH和ONOO−，而不与过氧化氢或超氧自由基反应，因此不破坏细胞信号传导机制[38, 39]。重要的是要强调，自由基的中和可以在细胞外空间（包括生物流体）以及任何细胞室中发生，包括血浆和线粒体膜，这是由于氢气分子的独特小尺寸，使其能够高度透过任何生物屏障[39, 40]。

抗炎效应

氢气的抗炎效应与其抗氧化效应密切相关，并涉及在其实施中相似或相同的初始机制。例如，氢气影响ASK1-和p38 MAPK依赖的调节途径，这些途径也参与炎症。过度产生生物自由基可以刺激炎症反应，这是由于激活了NF-kB、p53基因、缺氧诱导因子-1α、基质金属蛋白酶等[41, 42]。

抗凋亡效应

研究表明，氢气可以对细胞死亡过程（包括自噬和凋亡）产生多方面的影响[43]。总的来说，这种气体通过影响调节凋亡的信号通路及其相关蛋白来抑制凋亡，包括磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）和糖原合成酶激酶-3ß（GSK3ß）[44]。使用氢气影响激活程度的级联，包括ASK1/JNK [45]、ERK 1/2 和 MEK 1/2，并抑制半胱天冬酶3、8和9的活性，以及Bcl/Bax系统[45, 46]。此外，氢气的抗凋亡效应与上述两种效应密切相关，因为减少炎症反应的严重程度和缓解氧化应激降低了通过凋亡去除细胞的需求[47]。自噬的调节有助于降低凋亡的强度，形成这两个过程之间的重要平衡。

调节自噬

自噬，也称为部分巨自噬，是一种支持细胞稳态的分解代谢过程，其实施涉及溶酶体和泛素-蛋白酶体系统[48]。这一过程最初具有独特的生理意义，在某些条件下（特别是在异常强度和/或持续时间的压力作用下）获得不适应的特性[49]。已经表明，氢气对自噬过程可能有双重效应。一方面，氢气可以刺激特定的核苷酸结构域并抑制巨噬细胞中的NLRP3，限制炎症反应[50, 51]。这可以通过刺激自噬并提供“细胞内更新”程序来实现保护效果。

抑制焦亡

焦亡是一种相对较新的程序性细胞死亡形式，与凋亡根本不同，它会引起炎症反应。在这种情况下，炎症是由特殊结构称为炎性体的图案识别受体的激活引起的[52]。人们认为这种机制具有保护性质，但过度刺激这一过程有助于病理的发展或进展。诱导焦亡的因素包括活性氧物种、casapase-1和炎性体[53]。根据上述数据，氢气具有抗炎和抗氧化作用，这可以阻止所有这些因素，防止焦亡的过度激活。

氢气引入身体的途径

目前，将氢气引入身体的途径范围极广。首先，重要的是要强调这些方法不仅在特定病理治疗的便利性上有所不同（例如，在皮肤病治疗的情况下，氢气浴可能是首选选项），而且还在分子的药代动力学上有所不同，这改变了其药理活性[38]。

氢气疗法最常见的选择是吸入各种组成的含氢气气体混合物、使用氢饱和水以及输注/注射用氢气饱和的氯化钠溶液[30]。这些途径各有特点、优势、劣势以及可能的不同分子作用机制。

大多数旨在评估使用氢气效果的研究使用了氢饱和溶液（即氢水、氢盐水等）。然而，关于氢气吸入的研究，特别是在临床使用中，正在增加[29, 35, 36, 54]。氢气吸入对实验室动物和人类来说都是一种相当简单的接触方式。

确实，这是大泽等人[36]使用缺血-再灌注的大鼠模型所采用的方法。此外，该技术的一个重要优势是通过调节氢气在混合气体中的暴露时间和浓度[38, 55]，可以精确定量地给予氢气。吸入氢气在慢性阻塞性肺病[56, 57]和重症支气管哮喘[58]中的有效性也已有报道。这种方法的合理性与氢气抗氧化和抗炎特性的剂量可变性有关[38, 43]。

在临床实践中引入氢气最方便的方法是饮用富含氢气的水。这种方式消除了治疗过程中爆炸和火灾的危险，并确保其便携性，为广泛使用含氢水打开了可能性。然而，这条路线也有与气体溶解度低相关的不利因素[38]。众所周知，在正常大气压和室温下，溶解氢的饱和度为0.78 mM (1.57 mg/L)[59]。这一情况可能很重要，因为它并不总是能够达到确保完全临床效果所需的分子剂量。此外，使用这种途径时，应考虑到制备的氢气水应立即使用，因为它保持氢气浓度的时间非常短。而且，摄入氢气水后，大部分(>90%)会通过正常呼吸排出[60]。这至少表明，氢气通过胃肠道的高吸收率进入静脉系统，然后到达肺部并被呼出。同时，饮用氢气水后，氢气在不同组织和器官中的分布并不相同。特别是，当使用正在考虑的给药途径时，氢气穿透脑细胞的能力最小[61]，这对于确定其临床使用的适应症可能具有根本性的重要性。

将氢气引入体内的第三种主要途径是使用注射和输液的氢气饱和等张盐水溶液[35, 38, 55]。指定路径也有优点和缺点。首先，这条路径允许高精度地定量注射的氢气量，使用不同的浓度，增加药物对目标器官的生物利用度，并且如果需要的话，可以在严格定义的组织区域进行局部效果（例如，表面定位或插管和注射区域）。同时，注射氢气溶液存在一定的侵入性风险，因此可能导致感染，并且还需要经验丰富的医务人员进行操作。这些解决方案主要通过静脉注射（在患者中）或腹膜内注射（在实验室动物的实验研究中）进行管理[35]。在我们看来，这种给药途径的临床潜力尚未得到充分开发，正如基于医用气体效应的丰富的静脉臭氧疗法经验所示[62, 63]。

因此，目前存在多种将氢气引入体内的方法，不仅在局部和物理化学参数上有所不同，而且在分子作用的药代动力学上也有所差异。

氢气对各种细胞库和再生过程的影响

如前所述，氢气的多因素生物活性为其调节从早期前体—干细胞开始的细胞形成过程提供了前提。这一假设得到了体外和体内获得的实验数据的支持，证明了氢气对所有分化细胞形成阶段的积极影响（见图24.2）。

图 24.2氢气对干细胞状态的影响。该图展示了分子调节器（由红色云团表示）以及它们引起的细胞效应（绿色块），这些对于干细胞的功能至关重要。缩写：HSP–热休克蛋白，CFU–集落形成单位，HO–血红素加氧酶，TNF–肿瘤坏死因子，IFN–干扰素，CD–群集分化标记，MSC–间充质干细胞，GFAP—胶质纤维酸性蛋白，IL–白细胞介素。经允许转载自《氢气：从分子效应到干细胞管理》，作者Mikhail Yu. Artamonov等，《抗氧化剂》2023年，第12期，第636页。

应特别注意氢气对mtUPR的影响，这是最近发现的一个涉及线粒体功能[64]和在逆境中细胞存活[65]的介质。这种影响可能与刺激热休克蛋白(HSP)的产生[66]有关。氢气对mtUPR的刺激效应表现为eIF2a磷酸化水平的变化[66]以及ATF4 [67]和ATF5 [68]表达的偏移。这样的级联反应提供了蛋白质折叠过程的激活。此外，这种反应通过诱导HSP60 [69]而得到促进，从而增加胶原蛋白的合成，这对细胞生长和细胞间物质的形成都是必需的。氢气可能增加其细胞增殖的另一个因素是其激活GFAP（胶质纤维酸性蛋白）的能力，这是胶质母细胞瘤细胞分化的标志物[70]。

确保新兴细胞增殖、分化和生长过程激活的一个重要方面是干细胞微环境的发展。这通过增加集落形成因子的数量以及细胞因子的调节效应来实现。特别是，使用氢气会诱导CCL-2的激活，从而导致促炎细胞因子（TNFα， IL-6, IFN-y）水平的降低[67]。确定这些细胞因子浓度降低的第二个机制是NF-kB的抑制，这也可以通过氢气来调节[71]。此外，氢气诱导的另一个抗氧化/解毒酶是血红素加氧酶-1。这种酶作为一种强效抗氧化剂[72]，并促进抗炎细胞因子IL-10的合成以及细胞表面分化标记的形成[71]。尽管几项研究使用了各种类型的癌细胞，但综合结果表明氢气可能为干细胞的加速增殖、分化和生长提供条件。

氢气的这种属性对于再生医学非常重要，因为它的主要任务是为刺激组织再生过程开发最为温和的技术。氢气的分子、细胞和组织效应的结合表明了其多方面的促再生活性，其中一些方面如图24.3所示。特别是，氢气减少自由基损伤的能力是其根本价值。缓解伤口或其他组织缺陷组织中不可避免的明显氧化应激是细胞再生的关键[73, 74]。通过抗炎作用[74,75,76]以及形成细胞间质组分（特别是胶原蛋白）也为恢复组织的细胞组成创造了有利条件。由于氢气的影响，直接替换细胞缺失是由于激活间充质干细胞及其增殖和分化的刺激而发生的。这一过程还受到一系列促再生细胞因子的诱导和调节，并且通过激活细胞粘附分子的表达而促进细胞迁移到确定的位置[77]。总的来说，氢气对间充质干细胞状态和组织再生过程的影响应被认为是有利的。

图24.3氢气对组织再生的影响。该图说明了氢气的效果，这可能对刺激干细胞的再生和分化有重要意义。缩写：IL–白细胞介素，TGF–肿瘤生长因子，ROS–活性氧物种，RNS–活性氮物种，VEGF–血管内皮生长因子，IGF—类胰岛素生长因子，ICAM-细胞间粘附分子，MCP-单核细胞趋化蛋白。经允许转载自《氢气：从分子效应到干细胞管理》，作者Mikhail Yu. Artamonov等，《抗氧化剂》2023年，第12期，第636页。

假设：骨内给药氢气

我们的假设是，富氢盐水可能是一种有前景的、有效的和安全的方法，用于刺激骨髓中的自体干细胞池，基于以下几点。氢气，一种新的医用气体，可能选择性地减少•OH和ONOO–，通过调节氧化应激和炎症发挥器官保护作用。它非常温和，不会干扰代谢氧化还原反应或破坏参与细胞信号传递的ROS。富含氢的盐水的主要优点是便于携带、易于给药且安全，具有类似的抗氧化效果。它在生理上任何剂量都是安全的。氢气的安全性得到了体内结肠细菌持续产生氢气并在血液中正常循环的事实的证明。此外，氢气的组织兼容性比许多其他抗氧化剂都要高，因为它是一种内源性物质。此外，氢气还可以穿透生物膜并扩散到细胞质、线粒体和细胞核中，从而保护核DNA和线粒体，表明它可能降低生活方式相关疾病和癌症的风险。

给药可以使用富含氢的普通盐水溶液进行。根据目前的数据，几乎所有可以通过静脉途径安全给药的药物都可用于骨内途径。如上所述，骨内途径已被证明是安全有效的，能够到达骨髓。

骨内氢气给药方法

骨内疗法的方法包括骨内阻滞，其本质是将批准用于静脉给药的局部麻醉药（通常是低浓度的可卡因或奴佛卡因）注射到海绵状骨组织中，以尽量减少骨内慢传导感受器的激惹，并减轻或解除疼痛。

骨内疗法的方法还包括骨内输注（推注或滴注）各种药物，目的是对局部病理过程的生化机制产生药物效果。

骨内疗法的方法还包括骨内给予生物溶液以及骨内给予已暴露于物理因素（例如激光照射）的气体溶液或血液。

骨髓内注射疗法是一种药物的骨内给药方式。骨内给药主要用于胃肠外给药，作为静脉通路的一种类似方法。对于胃肠外给药，药物可以被注射进任何成骨结构中：胫骨内髁、肱骨头、钙质骨、胸骨等。最重要的是药物处于身体的血管床中。

在骨内治疗中，药物的骨内给药位置是基础。我们在以下骨突起处进行骨内阻滞：颈椎、胸椎、腰椎和骶椎的棘突，髂骨前后翼的脊突，肩胛骨脊突，胸骨，肩峰，肱骨头，桡骨和尺骨的干部，颧骨，下颌骨，股骨转子，胫骨髁，腓骨头，内外踝，跟骨。

自1980年以来，作者们已经进行了超过40,000次骨内治疗程序，并且没有记录到单一严重并发症的案例。在确定由临床情况决定的骨内进入点后，我们用0.5%利多卡因溶液浸润皮肤和软组织直至骨膜。然后，通过麻醉后的软组织，将一根骨内或脊椎针刺入骨膜；将针刺入骨头深度为5–10毫米。我们移除针芯，连接含有5.0毫升0.5%利多卡因溶液的注射器，并进行抽吸测试，将2–4毫升血液抽入注射器。如果抽吸测试呈阳性——即注射器自由抽吸带有小滴脂肪的血液，表明针刺正确且血液来自海绵状骨组织。然后，不移除针头，混合注射器内容物，并将混合物注入海绵状组织中。

在确认了正确的骨内通道后，可以执行批准用于静脉使用的药品的骨内滴注给药。在我们的案例中，给予富含氢的盐水进行骨内滴注。

结论

所呈现的证据表明，富含氢的盐水可以通过刺激和动员骨髓中的自体干细胞池，通过骨内途径提供保护性和治疗效果。此外，氢主要被视为一种预防措施，其在已建立的疾病中的治疗效果需要进一步研究。我们也相信，富氢盐水可以作为任何疾病的辅助疗法与其他方法结合使用，因为它可以延缓疾病进程，减轻病情严重性，并增加治疗效果，从而提高患者的生活质量。在富含氢的盐水真正成为一种有前景的新疗法之前，需要进行大量的体外和体内实验来确定其有效性和可行性。我们还计划进行动物实验来测试这一假设。在有效的动物实验之后，多中心临床研究也是必要的，由于现有的临床研究有限，使用富含氢的盐水进行骨内给药的最佳策略也必须被探索。因此，在这一领域进行有针对性的研究可以为再生医学开辟新的视野，并为加速组织修复创造创新技术。