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目前用于分析miRNA (microRNA) 表达情况的方法有Northern杂交、微阵列和高通量测序技术以及实时定量PCR (qRT-PCR)。qRT-PCR因检测灵敏度高、研究成本低、结果重复性强且精准性高等优势，被广泛应用于基因表达的检测分析。稳定表达的内参基因，则是qRT-PCR结果精准的必要条件。然而，内参基因表达的稳定性常受到物种类型、发育阶段、环境胁迫等因素的影响而出现波动，不存在绝对稳定的内参基因。因此，筛选鉴定适用于不同条件下的适宜内参miRNA是必要的。近日，河南科技大学研究者发表在Horticulturae 期刊的论文中，筛选鉴定了适用于牡丹花芽不同发育阶段、不同组织的内参miRNA，可在研究分析中获得更加精准的数据。

研究内容

miRNA是真核生物中长度为20~24 nt的非编码RNA。随着植物miRNA研究工作的深入展开，它对植物生长发育、种子形成、脂类代谢、果实品质、逆境响应等的调控功能逐步被阐述。例如，miR172通过下调靶基因AP2的表达调控植物开花进程；miR156等在内外果肉中的差异表达参与红心猕猴桃果实色泽的形成。miRNA的表达水平对其靶基因的表达及植物生理进程具有重要的影响。

在已有的研究中，多个不同的内参基因被鉴定并用于衡量不同物种中miRNA的表达水平，其中U6 snRNA应用最为广泛。然而Peltier等研究发现，U6 snRNA的表达并非在所有情况下都稳定。在某些特定情况下，自植物中鉴别的内参miRNA的表达稳定性更高。例如，在柑橘溃疡病研究中，poly(A)-tailed miR162-3p和miR472是衡量miRNA表达情况最好的内参基因；水稻被根结线虫Meloidogyne graminicola感染后，miR390-5p和miR7694-3p被证实是最优的内参基因；在杨树再生过程中，U6-1、EIF4A和PP2A-2是衡量miRNAs和mRNAs水平的最适宜内参基因。

本文自小RNA测序数据库中选择了18个候选miRNAs，以芽和花的不同发育阶段、及盛花期的不同组织为试材 (图1)，利用Delta-Ct、geNorm、Best-Keeper、NormFinder和RefFinder算法，分析它们的表达情况。研究筛选出PC-5p-19095、mtr-MIR160b-p3和gma-miR394a-5p分别在晚花‘Lianhe’和早花‘Fengdan’的花芽发育过程中表达最稳定；mtr-miR159a则在不同品种的不同发育阶段的花器官中表达最稳定；PC-5p-4和PC-3p-871分别在晚花‘Lianhe’、早花‘Fengdan’的不同组织中表达最稳定。

图1. 研究所用牡丹试材照片。

为了验证筛选出内参miRNA的可信度，研究分析了在牡丹中特异表达的cpa-MIR319-p3_1ss20GT和mtr-miR166g-5p表达模式。结果显示：以最优的mtr-MIR160b-p3和gma-miR394a-5p为内参基因时，miR139在‘Fengdan’花芽发育阶段中的表达模式较为一致；而以表达最不稳定的mtr-miR159a_L-1为内参基因时，检测出miR139的表达模式则完全不同 (图2A)。miR166的表达模式分析同样呈现了类似的现象 (图2)。

图2. 以不同内参基因分析miR319 (A, C) 和miR166 (B, D) 在花芽发育阶段中的表达模式。

研究总结

本项研究筛选鉴定了适用于不同品种牡丹花芽发育阶段和不同组织中miRNA表达模式分析的内参miRNA。然而，本研究仍存在一些不足，没有将筛选所得的内参miRNA与已有的管家基因进行对比分析，这在未来的研究工作中需要加以考虑。

原文出自 Horticulturae 期刊

Zhang, C.; Song, C.; Chen, L.; Ma, H.; Zhang, Y.; Guo, D.; Guo, L.; Hou, X. Selection and Validation of miRNA Reference Genes by Quantitative Real-Time PCR Analysis in Paeonia suffruticosa. Horticulturae 2023, 9, 148.

撰稿人：殷学仁

专栏简介

“晓果仁”专栏由Horticulturae 期刊编委殷学仁教授 (浙江大学) 主持。该专栏旨在对Horticulturae 期刊的典型论文进行点评与推荐，同时关注果树研究的最新进展。

专栏编辑

殷学仁 教授

浙江大学农业与生物技术学院

浙江大学农业与生物技术学院教授、博士生导师。曾先后承担国家自然科学基金 (优秀青年基金、面上项目、青年基金)、国家重点研发计划课题、公益性 (农业) 行业专项 (课题)、霍英东教育基金会青年教师基金、973计划 (子课题)、863计划 (子课题)、浙江省自然科学基金 (杰出青年基金)、教育部博士点基金等基金项目。

研究兴趣：果实发育与品质、果实采后生物学与技术、果树与环境响应、植物激素及其相互作用、分子生物学。

Horticulturae 期刊介绍

主编：Luigi De Bellis, University of Salento, Italy

期刊重点关注温带到热带园艺的所有领域以及相关学科，主题包括果树、蔬菜、花卉、苗圃和风景以及草药和香料作物等，研究涉及整个园艺供应链。

2021 Impact Factor：2.923

2021 CiteScore：1.8

Time to First Decision：14 Days

Time to Publication：35 Days