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全扫描癌症突变的精准基因组编辑 精选

已有 4835 次阅读 2023-3-19 07:35 |系统分类:海外观察

全扫描癌症突变精准基因组编辑

癌症从根本上说是一种遗传疾病。改善其治疗需要更深入地了解个体基因突变以及它们如何影响疾病进展。然而,对癌症的复杂基础进行建模并非易事。 Francisco J. Sánchez-Rivera在麻省理工学院(MIT)运营着一个致力于这一挑战的实验室,使用精确的基因组编辑来产生单核苷酸突变,然后研究它们对癌症发展的影响。该实验室的精确方法通过复杂的“传感器序列”来实现,这些“传感器序列”可以监控编辑效率,包括评估碱基编辑器是否导致了任何不需要的突变。Sánchez-Rivera 及其同事与安捷伦科技公司合作,使用 SurePrint 高保真寡核苷酸文库合成 (HiFi OLS) 平台开发了足够可靠的传感器。

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这位癌症生物学家Francisco J. Sánchez-Rivera解释了安捷伦为各个领域的实验室开发的 HiFi 寡核苷酸合成技术如何帮助他的团队突破癌症研究的界限。

Precision genome editing puts cancer mutations under the spotlight (nature.com)

问:为什么要在特定突变水平上研究癌症?

每个基因都可以以数百甚至数千种方式发生突变,每个突变都可以产生自己的生物学效应。我们需要知道所有这些突变是如何单独发挥作用的,以了解癌症是如何发展和进展的。基于CRISPR的技术可以灭活或改变整个基因的表达,可以识别癌症的治疗靶点和生物过程。但他们没有模拟肿瘤中观察到的特定突变的影响,这些突变在癌症患者中可能会有很大差异。

问:您的实验方法是什么?

我们使用称为碱基编辑器的基于CRISPR的工具在基因序列中产生精确的单核苷酸变化。CRISPR Cas9切口酶蛋白产生单链DNA切口,然后物理连接到Cas9的碱基转换酶产生胞嘧啶到胸腺嘧啶的转换。我们通常使用病毒载体提供碱基编辑器,然后研究它们在细胞系或实验室小鼠中的作用。例如,我们可以确定给定的突变是否影响癌细胞增殖,或者它是否促进转移或耐药性。

问:您如何确定碱基编辑器引入了正确的突变?

这可能是一个棘手的问题:您不希望基本编辑器无意中改变其他附近的序列。我们解决这个问题的方法是将我们所谓的“传感器序列”嵌入病毒载体骨架中。该传感器包括与内源性靶位点的合成版本偶联的引导RNA。合成和内源性DNA序列同时发生突变。通过对传感器进行测序,我们可以确定给定碱基编辑器进行内源性变化的精度。

问:高保真寡核苷酸合成如何使这项研究成为可能?

在初步研究中,我们发现近一半的传感器在合成过程中出现了错误。由于我们的传感器设计方式以及长度,我们需要获得尽可能高保真度的寡核苷酸合成。幸运的是,我们能够利用安捷伦的 SurePrint HiFi OLS 平台。在它商业化之前,我们是beta测试人员,这确实是我们合成传感器结构的唯一方法。这些类型的传感器现在代表了我们实验室武器库的核心支柱。

问:您做了哪些工作来验证这种方法?

我们最近用它来研究人类肿瘤中发现的数千个突变,这些突变是由纽约纪念斯隆凯特琳癌症中心的研究人员收集的。我们表明,传感器编辑准确地报告了相应内源位点的编辑。

问:您的方法是否导致了癌症生物学的发现?

在获得这一验证后,我们开发了用于在p53肿瘤抑制基因中产生靶向突变的指导RNA组合。超过一半的癌症具有p53突变,阻止其激活抗肿瘤基因。我们确定了以前从未研究过的五个突变,并将它们引入含有p53基因野生型拷贝的胰腺上皮细胞中。当我们将这些编辑过的细胞植入小鼠体内时,所有动物都患上了胰腺肿瘤。根据我们的实验,我们现在也知道不同的突变会产生体内具有不同攻击性的肿瘤。这些研究表明,并非所有突变都是相同的,我们需要了解它们中的每一个如何驱动患者的不同生物学。

问:您的研究如何提高对癌症的理解和治疗?

如果我们能够通过肿瘤中的突变对患者进行功能分层,那么我们可以更好地理解和研究个体突变如何改变对治疗的反应 - 例如,包括可能针对突变p53的治疗。我们目前正在开发更精确的基于细胞的小鼠模型,以密切模仿患者的癌症生物学。

问:您的实验室下一步是什么?

我们的研究表明,使用SurePrint HiFi寡核苷酸文库可以同时询问数千个遗传变异。但是通过碱基编辑,我们只能设计过渡突变,例如胸腺嘧啶取代胞嘧啶。因此,我们错过了癌症患者中大约一半的突变。我们已经开始采用更新的“主要编辑”技术,使我们能够系统地设计给定基因中所有可能的突变,到目前为止,结果非常惊人。这些方法将帮助我们定义控制复杂遗传相互作用的所有机制,这将影响生物学和医学的所有领域。




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